組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)和免疫實(shí)驗(yàn)等的發(fā)展而得到廣泛的應(yīng)用。本文對(duì)其中的冰凍切片、石蠟切片、碳蠟切片、超薄切片、塑料切片等幾種常用的實(shí)驗(yàn)方法相關(guān)操作步驟進(jìn)行介紹。
冰凍切片
是免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng) 采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。
冰凍時(shí)，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時(shí)，影響較小，冰晶小而多時(shí)，對(duì)組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長(zhǎng)速率成正比，而與成核率(形成速率)成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對(duì)組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。Fish認(rèn)為冰凍開(kāi)始時(shí)，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C, 從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加達(dá)1018，然后再減慢?；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成。
(1)速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43。C的時(shí)間，減少冰晶的形成。其方法有二：
①干冰-丙酮(酒精)法：將150-200ml丙酮(酒精)裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時(shí)，溫度可達(dá)-70℃C，用一小燒杯(50-100ml)內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮(純酒精)飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-70℃時(shí)即可使用。將組織(大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存。
②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)(直徑約2cm)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí) 即開(kāi)始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。
(2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。
影響冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。目前冰凍切片機(jī)有兩類：
①恒慢冰凍切片機(jī)(Cryastat)：為較理想的冰凍切片機(jī)，型號(hào)很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于-30℃C低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm，完全能滿足免疫組織化學(xué)標(biāo)記要求。切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～18℃為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。
②開(kāi)放式冰凍切片機(jī)：包括半導(dǎo)體致冷切片機(jī)和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機(jī)。切片時(shí)暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術(shù)難度 大，在高溫季節(jié) ，切片更加困難，且切片厚8～15μm，不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉，國(guó)內(nèi)有生產(chǎn)。
冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)， 或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存
石蠟切片
其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過(guò)程應(yīng)在4℃。C下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應(yīng)限于2cm×1.5cm×0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過(guò)程中，石蠟應(yīng)保持在60℃以下，以溶點(diǎn)低的軟蠟最好(即低溫石蠟包埋)。
以上全過(guò)程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動(dòng)脫水機(jī)代替。如組織塊小，直徑小于0.5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過(guò)程只需4h左右。
石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2～7μm，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。由于甲醛固定、有機(jī)熔劑和包埋劑對(duì)組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報(bào)告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強(qiáng)度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應(yīng)入37℃恒溫箱過(guò)夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長(zhǎng)期貯存，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用。
石蠟切片優(yōu)點(diǎn)較多，但在制片過(guò)程中要經(jīng)過(guò)酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法(Freeze drying embedding methed)，可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(jī)(Freezing dryer)在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標(biāo)記、免疫酶標(biāo)記及放射自顯影。
振動(dòng)切片
用振動(dòng)切片機(jī)(Vibratotme)，可以把新鮮組織(不固定不冰凍)切成厚片20～100μm，以漂浮法在反應(yīng)板進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位，修整組織進(jìn)行后固定，最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。組織不冰凍，無(wú)冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對(duì)抗原的損害，能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究。這種包埋前染色，尤其實(shí)用于免疫電鏡觀察。
塑料切片
塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類(Glycol methacrylate, GMA)及環(huán)氧樹(shù)脂類(Epon 812,618)，其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)作光鏡和電鏡檢測(cè)，能相互對(duì)照所查抗原，定位準(zhǔn)確。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片，光鏡切片可薄至0.5～2um，故稱半薄切片(Semithin section)。GMA保存抗原較好，不與組織產(chǎn)生共聚合，但形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)欠佳。環(huán)氧樹(shù)脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，但在聚合過(guò)程中易和組織起作用，改變抗原結(jié)構(gòu)。塑料包埋切片由于處理程序繁多，抗原活性易丟失。同時(shí)半薄切片進(jìn)行免疫染色時(shí)，抗血清不易穿透樹(shù)脂，因此，塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標(biāo)本，切片薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)部位呈黑點(diǎn)狀，定位后進(jìn)一步作超薄切片，這樣，可以明顯提高免疫電鏡陽(yáng)性檢出率。
超薄切片
電鏡標(biāo)本制作，應(yīng)用超薄切片機(jī)(Ultrotome)進(jìn)行切片。
碳蠟切片
碳蠟(Carbowax)，學(xué)名聚乙烯二醇(Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟。根據(jù)其分子量不同，碳蠟有多種，如400、800、1000、1500、4000、6000等，用于組織包埋的有1500、4000兩種，其熔點(diǎn)分別38℃C和52。C左右，常溫下為固體石蠟狀，加溫熔化呈液體狀。
本法的特點(diǎn)是組織固定水洗后，不需脫水透明可直接浸蠟包埋，且切片方法與常規(guī)石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開(kāi)，碳虹迅速深化，組織片即可展平，制片過(guò)程簡(jiǎn)單易行。
具體操作簡(jiǎn)述如下：組織塊不宜過(guò)大，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內(nèi)。①組織固定后充分水洗去除固定液，用濾紙吸干組織表面水。②將組織浸入碳蠟(1500)內(nèi)，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液(1500和4000等量混合液)，52℃ 30min。④浸入等量混合碳蠟液(或根據(jù)氣溫、濕度變化調(diào)整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合，反之，則2：3混合)。⑤用等量混合碳蠟或調(diào)整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過(guò)程中，碳蠟組織塊應(yīng)盡量避免與水或冰接觸，貯存時(shí)應(yīng)密封干燥冷藏。
本法優(yōu)點(diǎn)是操作程序減少，時(shí)間縮短，組織不經(jīng)有機(jī)溶劑損害、溫度低、抗原性保存比石蠟切片好，組織結(jié)構(gòu)清晰。缺點(diǎn)是夏季室溫高時(shí)切片較困難，連續(xù)切片不如石蠟切片順利;由于碳蠟有強(qiáng)吸濕性，不易長(zhǎng)期保存。
從上文我們可看到，各種的組織切片方法的優(yōu)點(diǎn)和不足各不同，例如冰凍切片法能較好地保存抗原的活性但實(shí)驗(yàn)要求高，而石蠟法則在保存組織結(jié)構(gòu)完整性上表現(xiàn)出色但活性保存度低，而碳蠟法操作簡(jiǎn)單但不易保存。